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电子偏光显微镜的免疫细胞化学技术

发布人:shpuda发布时间:2014/1/23

    电子偏光显微镜免疫细胞化学技术又称免度电镜技术,它是把电子显微技术与免疫细胞化学技术结合起来,使抗原或抗体在亚细胞水平上得到定位的技术。由于抗原或抗体的结合产物在电镜下看不到,必须借用细胞化学方法,把抗体用脚、铁蛋白、胶体金、同位素等进行标记,根据标记物的不同,可分为免疫降细胞化学技术,免疫铁蛋白技术和免疫胶体金标记技术等。


    免疫胶体金技术


    1971年Faulk首次把胶体金作为特异性标记物用于免痊电镜技术,20多年以来,巳广泛应用于透射电镜下各种生物大分子的定位、定性、半定量等的研究,同时还应用于扫描电镜和光学显微镜的研究。
    原理:抓化金用还原剂处理,使其一合成特定大小的颐校,城位间由于静电排斥作用使其保持德定的胶体状态,称胶体金。胶体金在接近蛋白质等电点或稍偏碱的环境下带有负电量,能吸引抗体,从而把抗体标记,胶体金除可以和免疫球蛋白结合外,还可以和佰萄球菌A蛋白、植物血凝素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)等多种大分子结合,胶体金的这些特性有利于把胶体金用于多方面的标记研究。


    用胶体金标记的抗体进行示踪染色称免疫金染色(imraua>gukl staiming,1GS),在检查细胞抗原中,首先用特异性第一抗体(如单克隆抗体)与抗原结合,再与胶体金标记的第二抗体反应(间接法)或抗原直接与胶体金标记的第一抗体反应(直接法),在电镜下可见黑色圆形的金颗粒,即为抗原所在的部位。


    1.胶体金标记技术有以下优点:


    (l)胶体金颗粒电子密度高,又为网形,在电镜下易辨认,与铅染液、铀染液形成的沉淀物很容易区别,有精确的定位能力。


    (2)免疫胶体金染色非特异性吸附较低。


    (3)制备的胶体金颗粒可以有不同的大小,因此可进行双重和多重标记。


    (4)由于金颗粒具有高电子密度,有较强的发射2次电子的能力,是扫描电镜样品的理想标记物。


    (5)胶体金本身有颜色,它还可以用银增染,能满意地用于光学偏光显微镜观察。


    (6)金颗粒有较强的折光性,可用做流式细胞仪的标志物。


    (7)胶体金侧备过程比较简单,胶体金及其与免疫球蛋白等大分子的结合不涉及化学反应,但在侧备中要求精确的试剂浓度、PH值和离子强度。

    (8)胶体金技术还可以研究凝集素受体的定位。最近,有学者己把核酸杂交技术和胶体金标记技术结合起来,在亚细胞水平上研究各种核酸片段。

    2.胶体金标记的方法:胶体金标记在透射电镜上获得广泛的应用,它的标记方法有包埋前标记和包埋后标记。

    (1)包埋前标记:主要用于细胞表面杭原的定位和定量研究,可以用直接法和间接法,前者特异性好,后者敏感性高。胶体金标记技术除用于单标记以外,还可以用于双标记或多标记,即用二种或多种大小不同的金颐粒结合不网的第一抗体(或其他生物大分子),以标记细胞上相应的不同的抗原分子。


    由于金颗粒较大,不能通过完整的细胞膜,若检测细胞内的抗原,需用皂角求或其它去污剂等处理细胞,使细儿膜的通透性加大,以使金颐拉进人细胞。


    (2)包埋后标记:为了使胶体金与胞内杭原充分作用,用低滋包埋的切片,冷冻切片,有时也可以用常规包埋的切片做胶体金标记,这时被检测抗原需能耐受高温聚合的影响而不失去抗原活性。

 

 

 

 


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